PCR成分操作和選用的注意事項(xiàng)

[2015/1/15]

1) 水：必須是超純水。在1.5ml離心管內(nèi)保存。

　　(2) Buffer (緩沖液)

　　? 不同公司，不同的DNA Polymerase，對(duì)應(yīng)不同的Buffer。要清楚的區(qū)分。

　　? 切記要分裝，避免反復(fù)凍融。第一次從公司買(mǎi)來(lái)要分裝。一般是1ml。先250微升分裝到四個(gè)管內(nèi)。然后取一個(gè)管，分裝50微升到五個(gè)管內(nèi)。清楚標(biāo)記。 ?

　　特別注意Buffer (緩沖液)是否有鎂離子。如果沒(méi)有需要額外添加。

　　(3) dNTP

　　不同公司，不同的DNA Polymerase，對(duì)應(yīng)不同的dNTP，主要是融dNTP的溶液不同公司很有可能是不同的。要清楚的區(qū)分。

　　切記要分裝，避免反復(fù)凍融。第一次從公司買(mǎi)來(lái)要分裝。一般是1ml。先250微升分裝到四個(gè)管內(nèi)。然后取一個(gè)管，分裝50微升到五個(gè)管內(nèi)。清楚標(biāo)記。

　　(4) Primer (引物)

　　引物最核心，最重要的是特異性。學(xué)會(huì)如何利用基因組數(shù)據(jù)庫(kù)去判斷引物特異性。為了特異性，其他條件都是可以變動(dòng)的。其他條件都是子滿(mǎn)足特異性的前提下考慮的。

　　一般長(zhǎng)度為 23-35 個(gè)核苷酸。但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進(jìn)行反應(yīng)

　　理想的 GC 含量為 40-60%

　　計(jì)算的退火溫度(Tm)應(yīng)在 50-65℃

　　兩條引物間 Tm 差值應(yīng)在 5℃ 以?xún)?nèi)避免引物形成引物內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)(如發(fā)卡結(jié)構(gòu))以及引物二聚體

　　當(dāng)引入限制性位點(diǎn)時(shí)，需要在識(shí)別位點(diǎn) 5' 端額外添加 4-6 個(gè)堿基。如果直接用PCR產(chǎn)物要進(jìn)行酶切反應(yīng)，要額外添加6 個(gè)堿基

　　每條引物的終濃度應(yīng)為 0.1-0.5 μM; 引物濃度過(guò)高可能導(dǎo)致非特異性引物結(jié)合，并產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物 ?

　　如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率。
引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾。

　　引物的5′ 端決定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5′ 端修飾包括：加酶切位點(diǎn);標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3 等;引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列;引入點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變序列;引入啟動(dòng)子序列等。

　　引物的延伸是從3′ 端開(kāi)始的，不能進(jìn)行任何修飾。3′ 端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能。

　　(5) 模板：

　　如論是總DNA還是質(zhì)粒DNA純度要盡量高。對(duì)反應(yīng)是否成功至關(guān)重要。如果組織量容許，用試劑盒提取總DNA。如果組織量少，用實(shí)驗(yàn)室的手提方法。有兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：第一步加的提取液體積要過(guò)量，以便充分混勻。最后一步乙醇清洗要進(jìn)行兩次;干燥要徹底，管內(nèi)不能有液體。要用純水溶解。

　　如果DNA溶解不充分，可以在75-85度水浴中處理10-20分鐘，可以顯著促進(jìn)溶解。

　　要知道自己模板的濃度。

　　模板量根據(jù)反應(yīng)用的DNA Polymerase的要求確定。

　　如果PCR DNA產(chǎn)物用于分子克隆，適當(dāng)提高模板量，這樣可以減低PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)，從而降低引入突變的幾率。

　　(6)DNA Polymerase (DNA聚合酶)

　　如果是常規(guī)檢測(cè)，目前是有 Takara Ex-Taq; 如果是分子克隆，用Takara Prime Star;純粹學(xué)習(xí)目的，使用全式金Easy Taq，或是 Takara rTaq.

　　(7)建立好反應(yīng)體系后立即放入已經(jīng)預(yù)熱至變性溫度的熱循環(huán)儀中

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