本實(shí)驗(yàn)的目的是學(xué)會(huì)各種蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法。了解各種測(cè)定方法的基本原理和優(yōu)缺點(diǎn)。

　　蛋白質(zhì)含量測(cè)定法，是生物化學(xué)研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四種古老的經(jīng)典方法，即定氮法，雙縮尿法(Biuret法)、Folin-酚試劑法(Lowry法)和紫外吸收法。另外還有一種近十年才普遍使用起來(lái)的新的測(cè)定法，即考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)。其中Bradford法和Lowry法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏10～20倍，比Biuret法靈敏100倍以上。定氮法雖然比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往往以定氮法測(cè)定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。

　　值得注意的是，這后四種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)，因?yàn)橐环N蛋白質(zhì)溶液用這四種方法測(cè)定，有可能得出四種不同的結(jié)果。每種測(cè)定法都不是完美無(wú)缺的，都有其優(yōu)缺點(diǎn)。在選擇方法時(shí)應(yīng)考慮：①實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所要求的靈敏度和精確度;②蛋白質(zhì)的性質(zhì);③溶液中存在的干擾物質(zhì);④測(cè)定所要花費(fèi)的時(shí)間。

　　考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)，由于其突出的優(yōu)點(diǎn)，正得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。

　　一、微量凱氏(Kjeldahl)定氮法

　　樣品與濃硫酸共熱。含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨(消化)，氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計(jì)算得樣品之氮含量。若以甘氨酸為例，其反應(yīng)式如下：

　　H2O

　　O=CC=O

　　HNNH

　　R-CHCH-R

　　O=CCuC=O

　　HNNH

　　R-CHCH-R

　　H2O

　　反應(yīng)(1)、(2)在凱氏瓶?jī)?nèi)完成，反應(yīng)(3)在凱氏蒸餾裝置中進(jìn)行。

　　為了加速消化，可以加入CuSO4作催化劑，K2SO4以提高溶液的沸點(diǎn)。收集氨可用硼酸溶液，滴定則用強(qiáng)酸。實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法這里從略。

　　計(jì)算所得結(jié)果為樣品總氮量，如欲求得樣品中蛋白含量，應(yīng)將總氮量減去非蛋白

　　氮即得。如欲進(jìn)一步求得樣品中蛋白質(zhì)的含量，即用樣品中蛋白氮乘以6.25即得。

　　五種蛋白質(zhì)測(cè)定方法比較如下：

　　方法靈敏度時(shí)間原理干擾物質(zhì)說(shuō)明

　　凱氏定氮法

　　(Kjedahl法)靈敏度低，適用于0.2~1.0mg氮，誤差為±2%費(fèi)時(shí)

　　8～10小時(shí)將蛋白氮轉(zhuǎn)化為氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮(可用三錄乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離)用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測(cè)定;干擾少;費(fèi)時(shí)太長(zhǎng)

　　雙縮脲法(Biuret法)靈敏度低

　　1～20mg中速

　　20~30分鐘多肽鍵+堿性Cu2+?紫色絡(luò)合物硫酸銨;

　　Tris緩沖液;

　　某些氨基酸用于快速測(cè)定，但不太靈敏;不同蛋白質(zhì)顯色相似

　　紫外吸收法較為靈敏

　　50～100mg快速

　　5～10分鐘蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收各種嘌吟和嘧啶;

　　各種核苷酸用于層析柱流出液的檢測(cè);核酸的吸收可以校正

　　Folin-酚試劑法(Lowry法)靈敏度高

　　～5mg慢速

　　40～60

　　分鐘雙縮脲反應(yīng);磷鉬酸-磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原硫酸銨;

　　Tris緩沖液;

　　甘氨酸;

　　各種硫醇耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng);操作要嚴(yán)格計(jì)時(shí);

　　顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化

　　考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)靈敏度最高

　　1～5mg快速

　　5～15分鐘考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，其lmax由465nm變?yōu)?95nm強(qiáng)堿性緩沖液;

　　TritonX-100;

　　SDS最好的方法;

　　干擾物質(zhì)少;

　　顏色穩(wěn)定;

　　顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化