細胞培養(yǎng)基本要點

　　(一)準備和安裝過濾器　(二)合成培養(yǎng)基的配制　(三)小牛血清的處理　(四)生長培養(yǎng)基的配制

　　(五)凍存細胞的復蘇　　(六)傳代　　　　　　　(七)凍存　　　　　　(八)注意事項

　　(一)準備和安裝過濾器

　　清洗好過濾器，干燥，放入一張孔徑0.22μm的微孔濾膜，用布包裝好，15磅20 min進行高壓滅菌處理。 在超凈臺內打開過濾器架好，膠管一端接入濾泵再插入待除菌的液體中，出口端膠管深入到已消毒好的瓶子中。用泵過濾，過濾后要檢查濾膜是否完好無損。

　　(二)合成培養(yǎng)基的配制

　　1、根據(jù)細胞目錄中的說明，按下表選擇合適品牌及貨號的培養(yǎng)基干粉，用適量超純水充分溶解。

　　2、 按要求添加碳酸氫鈉、谷氨酸鈉、HEPES等，充分攪拌使之溶解。

　　3、 調 pH至7.2左右。

　　4、 加水至最終體積。

　　5、 在超凈臺中對溶液進行濾過除菌，分裝入250 mL或500 mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞緊瓶口。

　　6、 瓶口封好，4℃冰箱貯存。

　　(三)小牛血清的處理

　　市場上出售的小牛血清一般做了滅菌處理，但在使用前還應做熱滅活處理，即通過加熱的方法破壞補體(近來也有觀點認為熱滅活處理是不必要的)。胎牛血清不必滅活。

　　1、 將血清加熱至56℃并保持30 min，其間要不時輕輕晃動，使受熱均勻，防止沉淀析出。

　　2、 處理后的血清貯存于4℃。

　　3、 小牛血清在使用前最好進行篩選以掌握血清的質量。

　　(四)生長培養(yǎng)基的配制

　　除無血清培養(yǎng)之外，各種合成培養(yǎng)基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和抗菌素。

　　培養(yǎng)基分裝成小瓶(100～200 mL)以便使用，翻帽塞塞緊瓶口。

　　按如下比例配制： 基本培養(yǎng)基占80%~90%，小牛血清或胎牛血清占10%~20%。 按1%體積分數(shù)加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U/mL和100 μ/mL，。

　　(五)凍存細胞的復蘇

　　應遵守慢凍快融的原則。先將水浴鍋調至37-37。5度，取出凍存的細胞迅速放入后將細胞面浸至水面以下不斷搖動至融化。

　　在無菌臺內將完全培養(yǎng)基加入50ml的小培養(yǎng)瓶內，約5ml左右，然后用無菌吸管從凍存管內取出細胞，置培養(yǎng)并內輕輕搖晃，使細胞均勻后置培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。

　　(六)傳代:

　　貼壁細胞:

　　對于貼壁細胞應先吸(倒)盡培養(yǎng)基，吸的越干凈越好，以免中和后加入的消化液，使強度減弱(或PBS洗1-3次)。50ml培養(yǎng)瓶加入消化液約1-3ml，按此比例進行消化，(根據(jù)經驗)，晃動使消化液鋪均勻置37度培養(yǎng)箱約2-5分鐘，鏡下見細胞收縮變圓或少數(shù)脫落后，輕輕振動瓶底使細胞全部脫落，加入2-3ml完全培養(yǎng)基后，輕輕吹打，使細胞基本成單個懸浮，然后分置其它無菌培養(yǎng)瓶內，加入完全培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)或實驗。

　　懸浮細胞:

　　一般傳代可直接將細胞原液分置其它培養(yǎng)瓶內，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，如要高濃度可先離心1000rpm，5min后加入完全培養(yǎng)基，輕輕吹勻后，分置其它培養(yǎng)瓶內加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

　　(七)凍存

　　將貼壁細胞消化后離心收集，懸浮細胞直接離心收集，以完全培養(yǎng)基或胎牛血清重懸細胞至終濃度約106/ml。加入10%的DMSO。以每管1～2ml分裝至凍存管中。用絕熱材料包裹置-70攝氏度冰箱冷凍過夜。次日保存到液氮中。

　　(八)注意事項

　　玻璃吸管和玻璃培養(yǎng)瓶的消毒:1)高壓蒸汽滅菌15分鐘以上;2)干烤消毒140度2小時以上;

　　無菌工作臺先清洗后用75%酒精擦拭干凈，紫外線照射40分鐘以上;各種培養(yǎng)板照射3小時以上;

　　培養(yǎng)基(pH7.2)和血清配制好后要做無菌試驗:將血清按10%加入培養(yǎng)基內，用無菌的玻璃離心管或玻璃瓶取完全培養(yǎng)基5-10ml置培養(yǎng)箱內培養(yǎng)2-3天，肉眼見無渾濁或沉淀等異物。分裝后置4度保存;

　　消化液(pH7.8)或其它加入液，應用高壓蒸汽滅菌或一次性無菌濾器過濾除菌，分裝成支置-20度保存;

　　培養(yǎng)箱應先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍(如有紫外線的應照射1小時以上，如有高溫滅菌的應按程序來菌)。至少每月一次。

　　進入操作時應注意先清洗雙手及手腕，然后用75%酒精擦拭，操作時注意無菌臺內空間層次。手及物品不要在暴露的瓶口上方來往，如果數(shù)量較多，培養(yǎng)瓶應放在與酒精燈平行地方便于操作，瓶與瓶之間應相隔一定的距離，開瓶(蓋)時應先用75%酒精反復擦拭或用燈燒，打開后應用燈先燒口，然后燒蓋。用完后同樣操作。整個操作過程盡量在無菌臺靠里面一點。